Inhalt
Über den Test
Wie funktioniert der Test?
Jede Person tritt einzeln von außen an den Container. Zuerst werden der Testperson Fragen zu ihrer Person und Gesundheit gestellt. Diese notiert der Mitarbeiter und die Testperson kann das Notierte über einen Bildschirm mitverfolgen. Dann nimmt ein Mitarbeiter in Schutzkleidung den Rachenabstrich durch das Fenster. Die Testperson wird aufgefordert nach oben zu schauen und den Mund zu öffnen. Der Test dauert in der Regel 5 – 10 Minuten. Das Röhrchen wandert danach im Container in einen zweiten Raum mit moderner Labortechnik. Geschultes Personal isoliert die genetische Information und zerstört den infektiösen Teil. Anschließend wird die nicht-infektiöse Probe an verschiedene Labore zur PCR-Analytik weitergegeben.
Wer wird getestet?
Im Rahmen des Projektes werden in dem Zeitraum März – Oktober 2020 unterschiedliche Kohorten an den drei Standorten getestet. An der LUH werden Mitarbeiter*innen der Leibniz Universität sowie Mitglieder des Staatstheaters und der Staatsoper getestet. Auf dem Sartorius Campus in Göttingen nehmen Mitarbeiter*innen von Sartorius und externen Firmen an der Testreihe teil. Zielgruppe des Containers an der Schillerschule sind Schüler*innen, Eltern und Lehrer*innen.
Die Probandenrekrutierung für die MCA-Testreihe wurde bereits abgeschlossen. Leider können wir keine neuen Testpersonen aufnehmen.
Wie lange dauert die Auswertung?
Wir bemühen uns die Proben schnell zu analysieren. In der Regel werden die Ergebnisse innerhalb von 24 Stunden zugestellt. Bei einem erhöhten Testaufkommen kann die Bearbeitung der Ergebnisse sich etwas verzögern. Wenn Proben an einem Samstag abgegeben werden, können wir die Ergebnisse erst am Montag bereitstellen.
Unsere Labore analysieren die Proben schnellstmöglich und die Ergebnisse werden anschließend per Mail mitgeteilt.
Was passiert mit den Daten nach der Ergebnisbekanntgabe?
Alle Daten bleiben bei uns weiterhin sicher hinterlegt und sind nicht frei zugänglich. Der Datenschutz hat bei uns hohe Priorität. Wenn Testpersonen dennoch ihre Einwilligung der Datenspeicherung zurückziehen wollen und möchten auch nicht mehr an weiteren Tests teilnehmen, werden wir die Daten selbstverständlich löschen. Senden Sie uns dazu einfach eine kurze Nachricht
Was passiert bei positiven Ergebnissen?
Bei einem positiven Testergebnis wird die Testperson telefonisch informiert und ärztlich beraten. In diesem Telefonat werden Sie dann auch über das weitere Vorgehen aufgeklärt.
Ich möchte einen Corona Test machen. An wen kann ich mich wenden?
Die MCA-Testreihe basiert auf der regelmäßigen Teilnahme von definierten Kohorten. Wir können leider keine Einzeltests anbieten. Menschen mit akuten, coronatypischen Symptomen, Einreisende aus Risikogebieten und Personen, die Kontakt zu Infizierten hatten, haben Anspruch auf einem kostenlosen Corona Test und können sich hierzu an ihren Hausarzt wenden. Weitere Informationen erhalten Sie auf den folgenden Seiten: www.hannover.de und Kassenärztliche Vereinigung Niedersachsen
Was ist das Corona Virus?
Das Coronavirus ist ein umhülltes Virus mit einzelsträngiger Plusstrang RNA als Genom. Namensgebend sind die charakteristischen stachelartigen Fortsätze auf der Hülle des Virus, welche an eine Krone erinnern (corona lat.- „Kranz, Krone“). Diese Fortsätze bestehen aus Spike-Proteinen und sind entscheidend für die Anheftung des Virus an die Wirtszelle. Nachdem das Virus in die Wirtszelle gelangt, nutzt dieses die Translations- und Replikationsmaschinerien der Wirtszelle, um die Virusbestandteile in großen Mengen zu erzeugen. Die einzelnen Bestandteile lagern sich anschließend spontan selbst zusammen (self-assembly) und verlassen die Wirtszelle übern den Exocytoseweg. Diese Viren können nun weitere Zellen befallen und nach einer Inkubationszeit von bis zu sechs Tagen erste Krankheitssymptome auslösen. Ende Dezember 2019 wurden in der Hubei-Provinz, China die ersten Fälle einer Atemwegserkrankung mit unbekannter Herkunft beobachtet und mit einem Fischmarkt in der Stadt Wuhan in Verbindung gebracht. Am 12. Januar 2020 veröffentlichten chinesische Forscher die genetische Sequenz eines neuen Coronavirus, welches als severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) bezeichnet wird. Die vom Virus ausgelöste Krankheit wird coronavirus disease 2019 (COVID-19) genannt.
Wie läuft unser Nachweis ab?
Die quantitative PCR (qPCR) ist eine hochsensitive Methode zum Nachweis von genetischem Material. Im MCA Projekt werden in Dreifachbestimmung zwei virale Gene sowie das Gen des humanen Ribonuclease-Proteins P (RPP) nachgewiesen. Die Primer, die von Drosten (Charité Berlin) beschrieben sind, binden spezifisch nur an die Gen-Sequenzen von SARS-CoV-2, sodass eine Unterscheidung von anderen Viren vorgenommen werden kann. Zur Diagnostik stehen vier Sars-CoV 2 Gene zur Verfügung: die beiden Gene N1 und N2 für das Nucleocapsid von SARS-CoV-2, das E-Gen, dass die Virenhülle (Envelope) codiert und das Gen für die virale Polymerase RdRP (RNA dependent RNA Polymerase). Zudem kann über den Nachweis von humaner RPP eine Aussage über den Erfolg des Rachenabstrichs und der anschließenden RNA-Isolation getroffen werden.
PCR Verfahren sind in der Lage einen bestimmten Abschnitt einer DNA-Sequenz, wie sie in einem Gen vorliegt, exponentiell zu vervielfachen. Die Spezifität hierbei erfolgt durch die Wahl der Primer, die als Ausgangspunkt für die Polymerase dienen. Primer sind kurze DNA-Sequenzen, die an einen komplementären DNA- oder RNA-Strang binden. Neben den Primern werden noch Sonden hinzugegeben. Sonden sind auch kurze, komplementäre DNA-Sequenzen, allerdings wurden an den jeweiligen Enden noch je ein Fluoreszenzfarbstoff als auch ein Quencher gebunden. Die Sonde bindet an einer Stelle auf dem zu amplifizierenden Abschnitt und wird von der Polymerase abgebaut. Die damit verbundene räumliche Trennung von Quencher und Farbstoff führt zu einer quantifizierbaren Fluoreszenzintensität, die ein Maß für die Menge amplifzierbarer Sequenzen ist.
Was ist PCR?
Mit der Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, engl. polymerase chain reaction) wurde die gesamte Biotechnologie und insbesondere die Molekularbiologie revolutioniert. Die PCR macht es möglich, innerhalb weniger Stunden DNA-Fragmente bekannter Sequenzen in vitro millionenfach zu vervielfältigen und auch zu manipulieren. Die zugrundeliegende Methode wurde 1983 von Kary Mullis in Kalifornien erfunden, wofür er 1993 den Nobelpreis für Chemie bekam. Die Firma Roche erwarb die Patente für dieses Verfahren. Die PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet, zum Beispiel für die Erkennung von Erbkrankheiten und Virusinfektionen, das Erstellen und Überprüfen genetischer Fingerabdrücke, das Klonieren von Genen und Abstammungsgutachten. Die PCR zählt zu den wichtigsten Methoden der modernen Molekularbiologie und viele wissenschaftliche Fortschritte auf diesem Gebiet wären ohne diese Methode nicht denkbar gewesen. Grundvoraussetzung für die Anwendung dieser Methode ist die Kenntnis der zu amplifizierenden Sequenz. Unter Zuhilfenahme dieser Sequenzen müssen einzelsträngige Primer (Oligonukleotide aus 17-24 Nukleotiden) konstruiert werden, welche der DNA-abhängigen Polymerase als Startsequenzen für die Reaktion dienen. Diese Primer binden komplementär an die Enden der DNA, die amplifiziert werden soll. Dazu muss die DNA zuvor durch einen Denaturierungsschritt einzelsträngig gemacht werden. Für einen PCR-Ansatz werden die Template-DNA, die Primer, die DNA-Polymerase, ein auf die Polymerase abgestimmter Reaktionspuffer sowie ein Nukleotidmix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) benötigt. Diese einzelnen Komponenten werden, in den für die Reaktion optimalen Konzentrationen, in einem Reaktionsgefäß gemischt. Die Reaktion selbst findet in einem als Thermocycler bezeichneten Gerät statt. Die PCR ist eine zyklische Reaktion, welche die bestimmte DNA-Sequenz amplifiziert. Nach einem initialen Denaturierungsschritt von fünf Minuten beginnt der Reaktionszyklus, welcher 25- bis 35-mal wiederholt wird. Dabei wird die eingesetzte DNA (Template) etwa 30 Sekunden bei 90-95 °C hitzedenaturiert, um beide komplementäre Stränge voneinander zu trennen. In einem zweiten Schritt wird auf etwa 50-65 °C abgekühlt, sodass die zwei Primer an die antiparallelen 3’-Enden des gewünschten DNA-Abschnitts hybridisieren können (Primerannealing). Die Temperatur in diesem Schritt sollte der Schmelztemperatur der Primer entsprechen und ist damit abhängig von den jeweiligen Primer-Sequenzen. Schließlich synthetisiert in einem dritten Schritt bei 72°C eine hitzestabile DNA-Polymerase von den Primern ausgehend den jeweils zweiten Strang der Ziel-DNA. Sie verlängert die Primer in 3’-Richtung komplementär zum DNA-Template. Somit entstehen im ersten PCR-Zyklus zwei neue DNA-Stränge, deren 5’-Ende durch die Primer definiert wird, während das 3’-Ende eine variable Länge aufweist. Diese neu synthetisierten Stränge dienen nun als Template für einen weiteren Amplifikationszyklus. Dadurch werden schlussendlich identische Kopien des gewünschten DNA-Abschnitts erzeugt. Die Elongationszeit im dritten Schritt wird der Größe der Zielsequenz angepasst. Diesem PCR-Grundschema wird häufig noch ein finaler Verlängerungsschritt (5-10 Minuten bei 72 °C) angehängt, um die DNA-Stränge komplett aufzufüllen.
Welche Antikörper verwenden wir und welche Ergebnisse liefern sie?
Der Antikörpertest SARS-CoV-2 ViraChip IgG der Firma viramed, der für den qualitativen Nachweis einer bereits durchlaufenen SARS-CoV-2 Infektion notwendig ist [1]., detektiert als miniaturisierter Protein-Microarray-Immunoassay IgG-Antikörper gegen spezifische Virus Antigene. Mit diesem Test wird ein breites Antigenspektrum mit den drei immundominanten SARS-CoV-2 Antigenen S1 und S2 (Untereinheiten des Spike Oberflächenproteins [2]) sowie N (Nukleokapsidprotein [3]) abgedeckt. Die aufgereinigten Oberflächenproteine sind in Triplikaten an definierten Positionen (Analytspots) auf einer Nitrozellulosemembran in einer Standard-Mikrotiterplatte gebunden. Während der Inkubation mit dem Serum der getesteten Probanden binden SARS-CoV-2-spezifische Antikörper an die Antigene auf dem Microarray. In Folge bindet das Konjugat an den Antigen-Antikörper-Komplex und es wird das Chromogen/die Substratlösung hinzugegeben und von einem an den Konjugat-Antikörper gebundenen Enzym, der Alkalischen Phosphatase, umgesetzt. Dadurch entsteht ein Farbumschlag und der Antigen-Antikörper-Komplex auf dem Microarray wird lila bis schwarz angefärbt. Nach weiteren Waschschritten und einer vollständigen Trocknung wird die Mikrotiterplatte mit dem ViraChip Scanner der Firma viramed gescannt und automatisch ausgewertet. Eine Probe wird als positiv bewertet, wenn mindestens gegen ein Virusantigen Antikörper in ausreichender Konzentration (> 100 ViraChip-Einheiten im Vergleich mit mitlaufenden Kalibratorkontrollen) nachweisbar sind. [4] In kleinen Kollektiven wurden für diesen Test eine Sensitivität von 77 % und eine Spezifität von 99 % nachgewiesen. [5]
Zusätzlich zum SARS-CoV-2 ViraChip IgG von viramed werden die Proben mit Hilfe des Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 Tests und einem cobas e411 der Firma Roche überprüft. Durch den parallelen Einsatz beider Testsysteme soll die Validität der Antikörpertestung erhöht werden. [6] Dieser Test weist die verschiedenen Antikörperklassen IgA, IgM und IgG gegen das spezifische SARS-CoV-2 Antigen N nach. Die immundominanten Antigene S1 und S2 werden nicht nachgewiesen. Bei dem Testprinzip handelt es sich um einen Doppelantigen-Sandwich-Immunoassay, die qualitative Auswertung erfolgt über eine Elektrochemilumineszenz (ECL)-Messzelle. Das Serum der Testpersonen wird im cobas e411 halbautomatisch mit drei verschiedenen Reagenzien inkubiert. Das erste Reagenz beinhaltet biotinylierte und das zweite Reagenz ruthenylierte rekombinante N-Antigene. Diese können spezifisch an SARS-CoV-2-spezifische Antikörper aus dem Serum binden. Das dritte Reagenz enthält magnetische Mikropartikel, deren Oberflächen mit Streptavidin bedeckt sind. Streptavidin hat eine starke Affinität zu Biotin und bindet an den Immunkomplex. Mithilfe eines magnetischen Feldes werden die Mikropartikel-Antikörper-Komplexe temporär an die Oberfläche der ECL-Messzelle gebunden. Durch Anlegen einer elektrischen Spannung und Zugabe von Tripropylamin wird in der Messzelle eine Chemilumineszenzreaktion initiiert und die Emission mit einem Fotomultiplier gemessen. Eine Probe wird ab einem Cut-Off Index
> 1,0 als reaktiv (positiv) bewertet. [7] In größeren Kollektiven konnte für diesen Test eine Sensitivität von 75,6 % und eine Spezifität von 91,7 % nachgewiesen werden. [8]
Die Validierung der beiden Testmethoden erfolgte jeweils in drei voneinander unabhängigen Durchläufen anhand von 30 Serumproben (12 positive, 18 negative), die im zertifizierten Labor von Dr. Hauß bei Limbach zuvor mit dem DiaSorin SARS-CoV-2 IgG Test untersucht und als positiv oder negativ eingestuft wurden. [9] Es gab eine Übereinstimmung von 99 % hinsichtlich der Einstufung positiv oder negativ, sodass die verwendeten Verfahren insgesamt als geeignet angesehen werden können. Für eine weitere, interne Spezifitätsbewertung der beiden Testsysteme wurden neben den oben genannten Proben Seren des Blutspendedienstes Niedersachsen aus 2015 und Seren aus dem Labor Limbach aus Jahrgängen vor dem Auftreten von SARS-CoV-2 getestet. Kreuzreaktivitäten mit den humanpathogenen Coronaviren SARS-CoV und MERS-CoV oder anderen Infektionen konnten so ausgeschlossen werden.
Literatur
[1] WHO: Advice on the use of point-of-care immunodiagnostic tests for COVID-19, 2020, https://www.who.int/news-room/commentaries/detail/advice-on-the-use-of-point-of-care-immunodiagnostic-tests-for-covid-19.
[2] Li, F.: Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. In: Annual review of virology, Vol. 3 (2016), Iss. 1, pp. 237-261.
[3] Tok, T.T.; Tatar, G.: Structures and Functions of Coronavirus Proteins: Molecular Modeling of Viral Nucleoprotein (2017).
[4] viramed: SARS-CoV-2 ViraChip IgG Test Kit – Gebrauchsanweisung, 2020, https://www.viramed.de/assets/images/content/downloads/Arbeitsanweisungen/F%C3%BCr%20ViraChip%202.0/2960_SARS-CoV-2_ViraChip_AL_IgG_de_RevB.pdf.
[5] Krüttgen, A.; Cornelissen, C.G.; Dreher, M. et al.: Comparison of four new commercial serologic assays for determination of SARS-CoV-2 IgG. In: Journal of Clinical Virology, Vol. 128 (2020), p. 104394.
[6] OKBA, N.M.A.; Muller, M.A.; Li, W. et al.: SARS-CoV-2 specific antibody responses in COVID-19 patients, 2020.
[7] Roche: Elecsys® Anti-SARS-CoV-2: Immunoassay für den qualitativen Nachweis von Antikörper gegen SARS-CoV-2, https://www.roche.de/res/content/11647/factsheet_elecsys_anti-sars-cov-2_v2__1_.pdf.
[8] Kohmer et al.: SARS-CoV-2 – Der richtige Nachweis. In: Deutsches Ärzteblatt 117 (2020), Heft 17, S. 866-871.
[9] Elgas et al.: Serologischer Nachweis einer Infektion mit dem Coronavirus SARS-CoV-2: Abklärung einer möglichen Immunität nach Infektion mit SARS-CoV-2. In: LaborAktuell der Limbach Gruppe (2020).
Welche Corona Tests gibt es?
Die aktuelle Teststrategie in Deutschland sieht den Nachweis von COVID-19 mittels PCR vor. Alternative Testverfahren zur patientennahen Labordiagnostik sind allerdings in der Entwicklung und teilweise bereits in den USA unter der Emergency Use Authorization (EUA) der FDA für den COVID-19 Nachweis zugelassen.
Viele dieser alternativen Methoden gehören, wie die PCR, zu den Nukleinsäuretests. Diese benötigen zwar immer noch spezielle Geräte der jeweiligen Firmen und sind daher für die Anwendung z.B. beim Arzt gedacht, vereinfachen die Durchführung und Geschwindigkeit der Diagnostik aber erheblich. Die Methode ist dabei oft der PCR ähnlich. Die Virus-RNA wird vervielfacht, im Gegensatz zur PCR mittels isothermaler Amplifikation, und anschließend über ein Fluoreszenzlesegerät nachgewiesen. Die Durchführung wird vereinfacht, indem der Abstrich des Patienten in eine standardisierte Kassette eingeführt werden kann. Außerdem können durch die isothermale Amplifikationen die Kosten für einen Test gesenkt werden.
Ein anderes Testverfahren wird von der Firma Sherlock BioSciences Inc. vertrieben und nutzt die CRISPR/CAS Technologie zur COVID-19 Diagnostik. Zum aller ersten Mal ist ein solches Testverfahren zum Einsatz in speziellen Laboren unter der EUA zugelassen worden. Nach einer isothermalen Amplifikation wird ein CAS-Protein zur spezifischen Detektion von SARS-CoV-2 verwendet. Mit Hilfe eines Lateral Flow Assays kann eine direkte visuelle Auswertung erfolgen, was ein großer Vorteil dieser Methode ist.
Eine weitere Möglichkeit der patientennahen Labordiagnostik besteht in sogenannten Antigentests, welche ohne Amplifizierung der Zielmoleküle auskommen. Der Vorteil besteht in einem geringen Materialaufwand, was hohe Testzahlen erleichtert. Ein Beispiel ist der Test der Firma Quidel Corp., der bisher aber nur für die Verwendung in speziellen Laboren zugelassen ist. Der Test weist in einem Lateral Flow Assay ein Nukleokapsid Protein des Virus nach, kann allerdings nicht zwischen den SARS-CoV Varianten unterscheiden. Ein Vorteil ist die Analysezeit von nur 15 Min.
Was ist Pooling, was ist Multiplexing?
Multiplex PCR
In der molekularen Diagnostik lassen sich die zu detektierenden Targets mittels PCR einzeln oder parallel nachweisen. Beim parallelen Nachweis spricht man von einer sogenannten Multiplex-PCR. Hierzu werden die Primerpaare für alle Targets (z.B. Gene, Viren, Bakterien, Erreger, etc) auf die gleiche Annealingtemperatur designed und gleichzeitig in den PCR Ansatz gegeben. Um die SARS-CoV-2 Diagnostik schneller und kostengünstiger durchführen zu können, kann ein qPCR-basierter Multiplex-Assay durchgeführt werden, um parallel zwei virale Gene und die Humankontrolle durch Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzsonden in einem Ansatz zu messen. Im Multiplex-Assays werden die drei Sonden, deren Primer- und Sondensequenzen bereits von der CDC (Centers for Disease Control and Prevention) publiziert wurden mit unterschiedlichen Farbstoffen gekoppelt. Eine Kombination der Farbstoffe FAM, Cy5 und ROX zeigt in Multiplex-Experimenten der drei Sonden, dass es nicht zu einem „Spillover-Effekt“ kommt, d. h. die gewählten Farbstoffe Cy5, ROX und FAM wurden nicht in den jeweils anderen Kanälen detektiert. Folglich ist eine Kompensation der Daten nicht erforderlich. Die erfolgreiche parallele Messung der drei Gene (zwei unterschiedliche virale Sars-Cov2 Gene und humanen RNase P als Abstrichkontrolle) würde bedeuten, dass sich die Kapazität jedes PCR Laufs mindestens verdreifacht.
Darüber hinaus ließe sich mittels Multiplex PCR der Influenza Nachweis mit einer Corona-Diagnostik kombinieren. Damit wäre die Differenzierung von Erregern bei einer virenabhängigen Symptomatik möglich. Ebenso könnten Co-Infektionen analysiert werden.
Pooling
Unter Pooling versteht man die Analyse von Sammelproben. Grundsätzlich lassen sich Primärproben (Abstriche) oder aufgereinigte Proben (RNA) poolen. Um eine unveränderte Rückstellprobe zu erhalten, ist es sinnvoller, die aufgereinigte RNA zu poolen. Zur Vermeidung von Verdünnungseffekten empfiehlt die FDA Minipools von maximal vier verschiedenen Testpersonen. Idealerweise poolt man Personen, die privat oder beruflich miteinander in direktem Kontakt stehen, z.B. eine Familie, eine WG ein (medizinisches) Team, etc. Ist der Pool negativ, sind alle Testpersonen negativ. Ist der Pool positiv, muss jede Poolprobe einzeln aus der Rückstellprobe nachgetestet werden. Dies ist ein nicht zu unterschätzender logistischer Aufwand von mehreren Stunden oder länger.
Ist Pooling die Lösung für die Testung?
Eher nicht, da die von den Behörden empfohlenen Minipools keine Vorteile gegenüber Multiplex-PCRs bieten und große Pools falsch positive und falsch negative Analysen fördern. Im Falle einer Ressourcenknappheit jedoch sind Poolverfahren eine Alternative, die es zu optimieren gilt.
Wie wird die Datensicherheit gewährleistet?
Zur Kapselung der MCA-Daten vom normalen Institutsbetrieb läuft die Infrastruktur für die MCA-Laboranalytik in einem eigenen Netzwerk ab. Zwei Server werden eingesetzt. Zum einen ein System, das als Controller für die Arbeitsplatzrechner dient.
Zum anderen ein System mit einer (nur lokal erreichbaren) Datenbank. Dieser Server hostet eine über einen Proxy gesicherte API als Datenbank-Schnittstelle und Zugriffsmöglichkeit für alle Client-Systeme. Die Datenbank-API ist aus Sicherheitsgründen nur lokal vom Server aus erreichbar. Zugriffe müssen kontrolliert durch einen Webserver vermittelt verlaufen. Dieser hostet eine Web-Oberfläche, die von den Benutzern zum Zugriff auf das System verwendet wird. Der Zugriff auf die API des Servers ist durch den Proxy gesichert und vermittelt je nach Zugehörigkeit eines Nutzers zu einer Nutzergruppe (Pre-Login, Labormanager oder Mitarbeiter) unterschiedliche Rechteebenen des Datenzugriffs. Die Kommunikation zwischen Server und allen Client-Anwendungen ist generell verschlüsselt.
Die Server-Festplatten, welche die Laborergebnisdaten enthalten, sind verschlüsselt. Sicherheitskopien dieser Daten liegen inkrementell und tagesaktuell in einem anderen Gebäude. Alle Festplatten der Arbeitsplatzrechner sind ebenfalls verschlüsselt und die Nutzerkontrolle wird zentral über den Server vermittelt. Alle Benutzer des Systems werden vor Antritt der Arbeit im Datenschutz unterwiesen und die Möglichkeiten Daten unauthorisiert zu verarbeiten oder unerlaubt zu kopieren wurden nach aktuellem Stand der Technik wirksam unterbunden.